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小分子化合物分析用 lc ms/ms：參數(shù)設(shè)置指南（附案例）。

LC-MS/MS小分子化合物分析參數(shù)設(shè)置指南LC-MS/MS是分析小分子化合物（、代謝物、環(huán)境污染物等）的技術(shù)。合理的參數(shù)設(shè)置是獲得高靈敏度、高選擇性和穩(wěn)定數(shù)據(jù)的關(guān)鍵。以下是參數(shù)設(shè)置要點(diǎn)及案例：一、關(guān)鍵參數(shù)設(shè)置要點(diǎn)1.液相色譜(LC)部分:*流動(dòng)相:/水或/水體系。通常提供更高靈敏度和更低背壓。添加揮發(fā)性緩沖鹽(如2-10mM甲酸銨、銨)或酸/堿(如0.1%甲酸、0.1%氨水)調(diào)節(jié)pH，優(yōu)化化合物離子化效率及峰形。避免非揮發(fā)性鹽。*色譜柱:根據(jù)化合物極性選擇C18()、C8、HILIC等。粒徑(1.7-3.5μm)和柱長(zhǎng)(50-150mm)影響分離度和速度。*流速:常用0.2-0.5mL/min(常規(guī)柱)或0.3-0.6mL/min(微徑柱)，平衡分離效率與質(zhì)譜離子化效率。*柱溫:通常30-50°C，提高重現(xiàn)性并降低背壓。*進(jìn)樣體積:根據(jù)濃度和柱容量?jī)?yōu)化，通常1-10μL。2.離子源(ESI或APCI):*離子化模式:ESI(適合極性和離子化化合物)或APCI(適合中等極性化合物)。*極性:根據(jù)目標(biāo)化合物性質(zhì)選擇正離子模式([M+H]?)或負(fù)離子模式([M-H]?)。*源溫度:常用300-600°C(ESI)，150-550°C(APCI)，促進(jìn)溶劑揮發(fā)。*霧化氣/干燥氣流速:優(yōu)化溶劑揮發(fā)效率，常用30-60L/h(ESI)，40-80L/h(APCI)。*毛細(xì)管電壓/電暈針電流:影響離子化效率，需優(yōu)化(e.g.，ESI+3.0-5.0kV)。3.質(zhì)譜(MS/MS)部分:*母離子選擇(Q1):選擇目標(biāo)化合物的準(zhǔn)分子離子([M+H]?，[M-H]?等)。*去簇電壓(DP)/碎裂電壓:優(yōu)化去除溶劑加合物，獲得清晰母離子峰。*碰撞池(Q2):*碰撞氣(CAD):通常設(shè)為中等水平(4-8)。*碰撞能量(CE):關(guān)鍵參數(shù)之一！優(yōu)化以產(chǎn)生豐度高、穩(wěn)定的特征子離子。不同化合物、不同子離子所需CE差異大。*子離子選擇(Q3):選擇1-3個(gè)豐度高、特異性強(qiáng)的碎片離子作為定量/定性離子。*駐留時(shí)間(DwellTime):保證足夠數(shù)據(jù)點(diǎn)(>15點(diǎn)/峰)，通常10-100ms/離子通道。二、案例分析：水中甲惡唑(SMX)檢測(cè)*目標(biāo):檢測(cè)環(huán)境水樣中痕量甲惡唑。*儀器:UHPLC(WatersACQUITY)+TripleQuadMS(Sciex5500+)*LC條件:*色譜柱:AcquityUPLCBEHC18(1.7μm，2.1x50mm)*流動(dòng)相:A:0.1%甲酸水溶液，B:0.1%甲酸溶液*梯度:0-1.0min(5%B)，1.0-3.0min(5%→95%B)，3.0-4.0min(95%B)，4.0-4.1min(95%→5%B)，4.1-5.5min(5%B)*流速:0.35mL/min*柱溫:40°C*進(jìn)樣量:5μL*MS條件:*離子源:ESI+*離子源溫度:550°C*霧化氣(GS1):50psi，干燥氣(GS2):50psi，氣簾氣(CUR):30psi*離子噴霧電壓(IS):5500V*MS/MS參數(shù)(MRM):*母離子(Q1):m/z254.0([M+H]?)*去簇電壓(DP):80V*碰撞能量(CE):優(yōu)化后為25eV*子離子(Q3):m/z156.0(定量離子)，m/z92.0(定性離子)*駐留時(shí)間:50ms/通道*結(jié)果:方法在0.1-50μg/L范圍內(nèi)線性良好(R2>0.999)，檢出限(LOD)達(dá)0.03μg/L，回收率92-105%，精密度(RSD)提示:參數(shù)優(yōu)化是迭代過程，需結(jié)合化合物性質(zhì)、基質(zhì)效應(yīng)和儀器性能進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)整，尤其關(guān)注流動(dòng)相添加劑、離子源參數(shù)和碰撞能量，確保方法穩(wěn)定、靈敏、可靠。

lc ms/ms 數(shù)據(jù)怎么定量？2 種常用定量方法詳解。

一、定量法：外標(biāo)法/內(nèi)標(biāo)法原理：通過建立目標(biāo)分析物濃度與儀器響應(yīng)值（峰面積/峰高）之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算未知樣品中該物質(zhì)的含量。1.外標(biāo)法(ExternalStandardMethod)*操作：配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在與待測(cè)樣品完全相同的色譜、質(zhì)譜條件下進(jìn)樣分析，lcms 分析多少錢一次，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（濃度vs.響應(yīng)值）。將待測(cè)樣品的響應(yīng)值代入曲線方程計(jì)算濃度。*優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，成本低，無需特殊標(biāo)記試劑。*缺點(diǎn)：*易受基質(zhì)效應(yīng)影響（樣品基體可能抑制或增強(qiáng)離子化效率）；*進(jìn)樣誤差直接影響結(jié)果準(zhǔn)確性；*對(duì)儀器穩(wěn)定性要求高。*適用場(chǎng)景：基質(zhì)簡(jiǎn)單、通量高的小分子定量（如代謝物、環(huán)境污染物）。2.內(nèi)標(biāo)法(InternalStandardMethod，IS)*操作：在樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中加入穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物（如13C、1?N標(biāo)記的同類化合物）。以內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)值為參照，lcms 分析公司，計(jì)算目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)比值，再通過比值-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。*優(yōu)點(diǎn)：*顯著抵消基質(zhì)效應(yīng)和儀器波動(dòng)的影響；*減少進(jìn)樣誤差；*準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好。*缺點(diǎn)：同位素內(nèi)標(biāo)合成成本高，且需化學(xué)性質(zhì)與目標(biāo)物高度匹配。*適用場(chǎng)景：復(fù)雜基質(zhì)（如血漿、組織）中的定量（如臨床檢測(cè)、生物標(biāo)志物驗(yàn)證）。---二、相對(duì)定量法：標(biāo)記法vs.非標(biāo)記法原理：比較不同樣品中同一目標(biāo)物的相對(duì)豐度差異，適用于組學(xué)研究中大規(guī)模目標(biāo)物的并行分析。1.標(biāo)記法(如TMT/iTRAQ)*操作：對(duì)不同樣品中的蛋白質(zhì)/多肽進(jìn)行化學(xué)同位素標(biāo)記（如TMT10/11-plex），標(biāo)記后混合為單一樣品進(jìn)行LC-MS/MS分析。通過報(bào)告離子（ReporterI）的強(qiáng)度比值計(jì)算不同樣品間同一肽段的相對(duì)含量。*優(yōu)點(diǎn)：混合后上樣消除分析波動(dòng)，多重樣本（16重）同時(shí)比較，定量精度高。*缺點(diǎn)：標(biāo)記效率可能不均一，標(biāo)記試劑增加成本，通量受標(biāo)記重?cái)?shù)限制。*適用場(chǎng)景：中通量蛋白質(zhì)組學(xué)差異分析（如細(xì)胞處理組vs對(duì)照組）。2.非標(biāo)記法(Label-FreeQuantification，lcms 分析價(jià)格，LFQ)*操作：各樣品獨(dú)立進(jìn)行LC-MS/MS分析，阜陽lcms 分析，通過比較色譜峰面積或MS1/MS2譜圖計(jì)數(shù)（如MaxQuant，Skyline軟件）計(jì)算目標(biāo)物在不同樣品中的相對(duì)豐度。需嚴(yán)格平行實(shí)驗(yàn)和化處理（如總離子流校正）。*優(yōu)點(diǎn)：樣本處理簡(jiǎn)單靈活，成本低，無通量限制，適合大規(guī)模樣本。*缺點(diǎn)：對(duì)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性要求極高，色譜保留時(shí)間漂移影響比對(duì)，定量精度低于標(biāo)記法。*適用場(chǎng)景：高通量蛋白質(zhì)組/代謝組學(xué)篩查（如臨床隊(duì)列研究）。---關(guān)鍵步驟共通點(diǎn)兩種方法均需：1.色譜分離優(yōu)化（減少共洗脫干擾）；2.質(zhì)譜方法優(yōu)化（選擇高特異性離子對(duì)，如MRM/SRM模式）；3.嚴(yán)格質(zhì)量控制（標(biāo)準(zhǔn)曲線R2>0.99，QC樣品RSD4.數(shù)據(jù)規(guī)范化處理（消除系統(tǒng)誤差）。---總結(jié)：外標(biāo)/內(nèi)標(biāo)法適用于定量，其中內(nèi)標(biāo)法抗干擾能力更強(qiáng)；標(biāo)記法與非標(biāo)記法則服務(wù)于大規(guī)模相對(duì)定量，分別在高精度與靈活性上各有優(yōu)勢(shì)。方法選擇需結(jié)合實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、樣本?fù)雜度及成本綜合考量。

生物樣品LC-MS/MS檢測(cè)：不容忽視的樣品保存黃金法則生物樣品的穩(wěn)定性是LC-MS/MS檢測(cè)成功的基石。忽視保存要點(diǎn)，可能導(dǎo)致目標(biāo)物降解、轉(zhuǎn)化或基質(zhì)效應(yīng)加劇，直接影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性與可靠性。以下關(guān)鍵環(huán)節(jié)務(wù)必嚴(yán)格把控：1.溫度控制：生命活動(dòng)的“暫停鍵”*立即處理與預(yù)冷：采集后（尤其是血液、組織），立即置于冰上（4℃）或預(yù)冷的離心管/保存管中，抑制酶活性與化學(xué)降解。*速凍是關(guān)鍵：需長(zhǎng)期保存（>24-48小時(shí)）的樣品（血漿/、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、尿液等），必須快速冷凍。推薦使用液氮或干冰，避免冰晶緩慢形成破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或目標(biāo)物（如蛋白質(zhì)、多肽、不穩(wěn)定的代謝物）。-80℃超低溫冰箱是長(zhǎng)期保存的金標(biāo)準(zhǔn)。*避免反復(fù)凍融：凍融循環(huán)是樣品穩(wěn)定性的大敵！每次凍融都可能導(dǎo)致目標(biāo)物降解、蛋白質(zhì)聚集或沉淀。務(wù)必分裝保存！將樣品預(yù)先分裝成單次檢測(cè)用量的小份，僅在使用時(shí)取出所需分量。標(biāo)記清晰，避免混淆。2.防腐與穩(wěn)定劑：抵御降解的“”*血液樣品：根據(jù)目標(biāo)物性質(zhì)選擇合適的抗凝劑（EDTA、肝素、檸檬酸鈉）。某些檢測(cè)需特定添加劑（如NaF抑制糖酵解酶保血糖穩(wěn)定；蛋白酶混合物保護(hù)多肽/蛋白質(zhì)）。*其他樣品：尿液、組織勻漿等也需考慮添加穩(wěn)定劑（如酸、堿、劑、螯合劑），具體需參照分析方法或文獻(xiàn)。添加任何穩(wěn)定劑前，務(wù)必確認(rèn)其不影響后續(xù)LC-MS/MS分析（如不引入干擾峰、不抑制離子化）。3.避光與惰性環(huán)境：減少“意外”反應(yīng)*避光：對(duì)光敏感的目標(biāo)物（如某些維生素、膽紅素、光敏及其代謝物），保存和操作全程需使用棕色避光管或在暗處進(jìn)行。*惰性氣體保護(hù)（可選）：對(duì)氧極度敏感的樣品（如某些多不飽和脂肪酸、還原性物質(zhì)），可在樣品上方充入氮?dú)饣驓庖灾脫Q空氣，減少氧化反應(yīng)。4.容器選擇與清潔：避免“額外貢獻(xiàn)”*材質(zhì)：聚（PP）材質(zhì)管。避免使用普通玻璃（易吸附、可能溶出離子）或含增塑劑的塑料管（如某些PVC管）。特殊檢測(cè)（如痕量金屬分析）需使用超潔凈管。*清潔度：確保容器無污染、無殘留。新管也可能含添加劑，必要時(shí)清洗。避免使用含洗滌劑殘留的容器，其可能嚴(yán)重干擾質(zhì)譜信號(hào)。5.記錄與監(jiān)控：可追溯的“生命線”*清晰標(biāo)記：樣品信息（ID、類型、采集日期時(shí)間、保存條件、添加物、分裝次數(shù)、凍融次數(shù)）必須清晰、牢固標(biāo)記。*溫度監(jiān)控：冰箱/冰柜需配備持續(xù)溫度記錄儀并定期校準(zhǔn)，確保實(shí)際溫度符合要求（-80℃冰箱實(shí)際溫度應(yīng)在-70℃至-80℃間）。液氮罐需定期補(bǔ)充液氮。*凍融記錄：嚴(yán)格記錄每次取用（凍融）的時(shí)間和操作人。總結(jié)：生物樣品的保存絕非簡(jiǎn)單的“放進(jìn)冰箱”。它是貫穿從采樣到上機(jī)前整個(gè)流程的精密管理，目標(biāo)是維持目標(biāo)分析物的原始狀態(tài)與濃度。嚴(yán)格遵守溫度控制、合理使用穩(wěn)定劑、避免物理化學(xué)應(yīng)激（光、氧、凍融）、選擇合適容器并做好詳實(shí)記錄，是確保您的LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、可重現(xiàn)的黃金法則。忽視任何一個(gè)環(huán)節(jié)，都可能讓寶貴的樣品和后續(xù)分析工作功虧一簣。

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